Chẩn đoán ngộ độc dựa trên việc xác định độc tố Clostridium botulinum trong phòng thí nghiệm và quan sát các triệu chứng lâm sàng, ngay cả khi đôi khi chúng không đặc hiệu. Trên thực tế, căn bệnh này có thể bị nhầm lẫn với hội chứng Guillain-Barré, bại liệt, đột quỵ, nhược cơ và liệt.
Trong ngộ độc thực phẩm, hình ảnh về rối loạn thần kinh cơ và ăn phải thực phẩm có khả năng bị ô nhiễm là manh mối quan trọng. Biểu hiện đồng thời ở ít nhất 2 bệnh nhân ăn cùng một loại thực phẩm giúp đơn giản hóa chẩn đoán. Xác nhận có được bằng cách phân lập vi sinh vật với nuôi cấy mẫu thực phẩm nghi ngờ hoặc phân của bệnh nhân và xác định độc tố botulinum trong thực phẩm hoặc vật liệu sinh học (như máu, dịch dạ dày và nôn).
Mặt khác, trong ngộ độc vết thương, việc tìm kiếm độc tố huyết thanh hoặc phân lập Clostridium botulinum từ một mẫu từ tổn thương da xác nhận chẩn đoán.
